Классическое бактериологическое исследование — «золотой» стандарт микробиологической диагностики.
Цель бактериологического исследования — выделение чистой культуры возбудителя и ее идентификация.
Алгоритм бактериологического исследования:
• первичная микроскопия исследуемого материала (необязательный этап, в зависимости от характера материала);
• первичный посев с целью выделения чистой культуры;
• накопление чистой культуры;
• изучение комплекса биологических свойств выделенной культуры;
• окончательная идентификация возбудителя.
1-й день исследования
1. Первичная микроскопия
Результат первичной микроскопии дает ориентировочное представление о наличии в клиническом материале различных морфологических форм микроорганизмов, а также позволяет провести их первичную идентификацию по морфолого-тинкториальным свойствам и существить выбор сред для первичного посева.
Гнойное отделяемое — первичная микроскопия обязательна.
Спинномозговая жидкость — первичная микроскопия осадка обязательна.
Мокрота — первичную микроскопию проводят из разведений 104-105.
Мазки из зева и носа — первичную микроскопию не проводят.
Кровь — первичную микроскопию не проводят.
Фекалии — первичную микроскопию не проводят.
2. Первичный посев
Исследуемый материал после первичной микроскопии или без нее (фекалии, моча, мазок из носа и зева, кровь) засевают на соответствующие среды, для выделения чистой культуры:
• сахарный бульон, кровяной агар — для стрептококков;
• желточно-солевой агар, кровяной агар — для стафилококков;
• среда Эндо — для бактерий семейства Enterobacteriaceae;
• МПА (мясо-пептонный агар) — для грамотрицательных бактерий;
• МПА (посев по методу Шукевича) — для выделения протея;
• среда Китта—Тароцци — для выделения анаэробов;
• среда Сабуро — для выделения грибов.
Посев является первым этапом бактериологического исследования (если не проводят первичную микроскопию).
Посев осуществляется следующим образом:
• Посев штрихом с обжигом петли. Материал забирают прокаленной бактериологической петлей и штрихом густо засевают верхнее поле чашки. Далее петлю опять прокаливают и вносят в густо засеянный сектор и проводят 2—3 вертикальные линии по всей чашке. После этого чашку переворачивают, густо засеянный сектор остается на нижнем поле чашки. Петлю опять прокаливают, и посев разносят по чашке 2-3 горизонтальными штрихами.
• Посев шпателем. Материал наносят на поверхность среды шпателем или пипеткой, а затем шпателем рассеивают по всей поверхности.
• Посев тампоном. Для посева тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в питательную среду.
• Посев по секторам. При таком посеве дно чашки расчерчивают на секторы, посев проводят штриховыми движениями от края чашки к центру и по секторам.
2-й день исследования
1. Проводят учет роста на питательных средах как однородный или неоднородный.
2. Проводят описание культуральных свойств.
В результате роста на питательной среде образуются колонии (потомки одной клетки). Отбирают изолированные колонии и изучают их — начинается второй этап исследования, направленный на изучение культуральных свойств бактерий. Знания этих свойств необходимы для идентификации полученной чистой культуры, так как каждому виду микроорганизмов при росте на определенной питательной среде соответствуют определенные культуральные свойства.
Колонии изучают:
• макроскопически: невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете;
• микроскопически: при малом увеличении сухой системы микроскопа.
В проходящем свете изучают:
• величину колоний (крупные, средние, мелкие, карликовые);
• форму колоний (правильная, неправильная, круглая);
• прозрачность колоний (прозрачная, непрозрачная).
В отраженном свете определяют:
• цвет (бесцветные или окрашенные);
• характер поверхности (гладкая, бугристая, блестящая, шероховатая);
• высоту колоний над поверхностью среды (вдавленная, плоская, возвышающаяся).
Микроскопически оценивают:
• край (ровный, неровный);
• структуру (гомогенная, негомогенная).
Изучение колоний заканчивается приготовлением мазка, окраской его по методу Грама и микроскопией.
При взятии материала из колонии для приготовления мазка оценивают ее консистенцию (мягкая, слизистая, сухая).
Если при микроскопии культура оказалась чистая, то ее пересевают на скошенный агар для накопления.
3-й день исследования
1. Описание характера роста на скошенном агаре:
• однородный, неоднородный;
• по штриху, сплошной, сливной.
2. Проверка чистоты накопленной культуры. Готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Если накоплена чистая культура, то она подвергается дальнейшей идентификации. Идентификация бактерий до рода и вида основана на изучении особенностей метаболизма — биохимическая идентификация и антигенного строения — серологическая идентификация.
3. Изучение биохимических свойств. Биохимические свойства — способность бактерий расщеплять те или иные субстраты за счет продукции соответствующих ферментов. Для изучения биохимических свойств используют дифференциально-диагностические среды, содержащие различные субстраты (пестрый ряд). В их состав входят среды Гисса с углеводами, лакмусовое молоко, желатин, среды с аминокислотами, МПБ (мясо-пептонный бульон) с индикаторами на сероводород и индол.
— Сахаролитические свойства изучают на средах Гисса. В их состав входят пептонная вода, субстрат-углевод (различные моно- и полисахариды), многоатомные спирты и индикатор.
Если у бактерий есть ферменты, расщепляющие субстрат-углевод, то они выделяют продукты метаболизма (кислоту или кислоту и газ). При кислотообразовании индикатор меняет цвет среды, при газообразовании регистрируют разрывы среды.
— Протеолитические свойства изучают при посеве на желатин и лакмусовое молоко. Если у бактерий есть протеазы, то желатин разжижается. В молоке появляется сгусток кремового цвета, а над ним жидкость — пептонизация молока (за счет того, что протеазы бактерий расщепляют казеин молока до пептона).
— Пептолитические свойства. Чаще бактерии способны расщеплять промежуточные продукты распада белков — пептоны. Продукты этого процесса: амины (скатол, индол), аминокислоты, газы (сероводород, аммиак, углекислый газ). Их можно обнаружить с помощью индикаторной бумаги:
— лакмусовая — для выявления аммиака;
— смоченная щавелевоуксусной кислотой — для выявления индола;
— смоченная ацетатом свинца — для выявления сероводорода. Продукты дезаминирования и декарбоксилирования аминокислот обнаруживают с помощью тест-полос, изменяющих свой цвет при изменении рН среды.
4-й день исследования
1. Проводят учет результатов биохимических тестов. После того как культура идентифицирована до вида, у нее изучают ряд дополнительных признаков, таких как чувствительность к антибиотикам, токсигенность, наличие факторов вирулентности, плазмидный профиль, а также проводят внутривидовую дифференцировку.
2. Результаты биохимической идентификации служат основанием для проведения серологической идентификации. Серологическую идентификацию выделенной культуры проводят в реакции агглютинации на стекле с помощью соответствующих иммунных адсорбированных сывороток, выбор которых определяется результатами биохимической идентификации.
Внутривидовая дифференциация — определение принадлежности штамма к тому или иному фаговару, бактериоциногеновару, бактериоциновару, биовару, резистовару и т.д. Она позволяет выявить эпидемиологические связи между штаммами одного вида.
Идентификация выделенной культуры позволяет сделать заключение о том, какой микроорганизм служит этиологическим фактором заболевания. При выделении условно-патогенных бактерий необходимо соблюдать критерии этиологической значимости:
— присутствие бактерий в материале из патологического очага в количестве не менее 105 КОЕ мл /г;
— повторное выделение из материала той же культуры;
— нарастания титра Ат в сыворотке крови больного к аутоштамму в 4 раза и более.
Определение фаговаров бактерий (фаготипирование)
Определение фаговаров проводят по эпидемиологическим показаниям для установления эпидемиологических связей между заболевшими. Для проведения исследования берут чашки Петри с МПА, подсушивают поверхность, расчерчивают дно на квадраты и маркируют. Далее 3-4-часовую культуру в бульоне засевают газоном, подсушивают и на каждый квадрат наносят каплю соответствующего типового фага в рабочем разведении. Посевы помещают в термостат на сутки. Через 24ч учитывают спектр чувствительности культуры к определенным фагам по литическому действию.
определение бактериоциновара
Для определения бактериоциновара определяют чувствительность исследуемых штаммов к эталонным бактериоциноварам. Как и фаго- типирование, его проводят по эпидпоказаниям.
Для проведения исследования соответствующие стандартные культуры-продуценты типовых бактериоцинов засевают на питательные среды. Посевы помещают в термостат при 37 °С на 48 ч.
Выросшие колонии индикаторных культур инактивируют хлороформом, после чего на поверхность наливают 2—4 мл расплавленного агара, в который предварительно вносят 0,2 мл исследуемой 4-часовой бульонной культуры. После того как агар застыл, посевы вновь помещают в термостат на 18—24 ч. Через указанное время учитывают наличие зон задержки роста вокруг индикаторных культур, тем самым определяют бактериоциновар изучаемых бактерий.
