Методы культивирования анаэробных бактерий
Культивирование анаэробных бактерий как спорообразующих (клостридии). так и неспорообразующих (вейлонеллы, бактероиды и др.) производят в анаэробных условиях.
Анаэробные условия можно создать при культивировании в анаэростате. эксикаторе (на дно которого устанавливается зажженная свеча, либо наливается щелочной раствор пирагалола. поглощающий кислород) и биологическим методом по Фортнеру. Малкиной и т.д.
При посеве методом Фортнера чашку Петри с толстым слоем питательного агара делят пополам, вырезанной полоской. На одну половину агара сеют культуру аэроба, на другую — анаэроба. Чашку заливают парафином и помещают в термостат. Сначала происходит рост аэробных бактерий. Когда же они исчерпают из чашки весь кислород, начинается рост анаэробов.
При посеве по методу Малкиной используют две пробирки со скошенным МПА, соединенных трубкой. В одну пробирку сеют культуру аэроба, в другую — анаэроба. Когда исчерпается кислород при росте аэробных бактерий, начинается рост анаэробных.
Посевы анаэробов производят на среде Китта-Тароцци. состоящей из МПБ. 0.5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша. Перед посевом среду прогревают в водяной бане в течение 10-15 мин для удаления воздуха и остужают. После посева среду заливают слоем вазелинового масла или парафином с целью изоляции от атмосферного воздуха.
Выделение чистых культур анаэробных бактерий
В практических лабораториях обычно для выделения чистых культур анаэробов используются методы Цейсслера или Вейнберга. Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.
Метод Цейсслера
Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму или другим методом и микроскопируют. При обнаружении подозрительных на анаэробы микробов исследуемый материал засевают на среду Китта-Тароцци. В случае необходимости предварительно исследуемый материал разводят стерильным 0,9% раствором ЫаС1. Пробирки заливают слоем вазелинового масла или парафина, подписывают и ставят в термостат при температуре 37 °С на 18-24 ч.
Второй этап. На следующий день посевы просматривают и описывают характер роста. Приготавливают мазки, окрашивают по Граму. микроскопируют, описывая морфологические и тинкториальные свойства бактеркй. Затем производят пересев в чашки Петри на сахарно-кровяной агар, для получения изолированных колоний. Чашки помещают в анаэростат и термостатируют при температуре 37 С 18-24 ч.
Третий этап. Просматривают посевы, изучают изолированные колонии и описывают характер роста. Морфологию бактерий исследуют приготовлением мазка из колонии, окрашенного по методу Грама. Далее для выделения и накопления чистой культуры производят пересев подозрительной колонии в пробирку со средой Китта-Тароцци. Пробирки термостатируют 18-24 часа при температуре 37 С.
Четвертый этап. Отмечают визуальный характер роста чистой культуры. Проводят проверку чистоты выделенной культуры, для чего ее микроскопируют (чистая культура морфологически и тинкториально однородна).
Бактерии синтезируют разнообразные ферменты, принадлежащие к 6 классам. Ферментный состав любого микроба определяется его геномом и является довольно стабильным признаком. Поэтому определение сахаролитических. протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами и даже вариантами (биоварами) бактерий имеют важное таксономическое значение, широко применяясь для ах систематики и идентификации. Целый ряд ферментов (гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств возбудителей, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.
Одни ферменты локализуются в цитоплазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве бактерий — эндоферменты, другие — экзоферменты, выделяются в окружающую среду. Функциональное значение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул в окружающей среде до более простых соединений.
Ферменты могут функционировать независимо друг от друга или быть тесно связанными между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в строгой последовательности. Последние носят название — мультиферментные комплексы (ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране).
У бактерий различают три основные группы ферментов:
1. Конститутивные — постоянно синтезирующиеся в микробных клетках.
2. Индуцибелъные — синтез которых индуцируется соответствующим субстратом.
3. Репрессибельные — синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.
Для идентификации микроорганизмов — возбудителей инфекционных болезней, кроме морфологических и культурных свойств, необходимо изучение биохимических признаков, к которым относят: сахаролитические, протеолитические свойства бактерий, пигменто- и токсинообразование.
Бактерии характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы. Утилизация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов.
Определение сахаролитических ферментов проводит на средах Гисса. состоящих из 1% пептонной воды. 0.5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, маннит и др.) и индикатора Андреде (кислый фуксин в 1н. растворе NаОН). В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов. Свежеприготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет Результаты посевов учитываются через 24-48 часов. О разложении углеводов судят по изменению цвета среды (она приобретает красный цвет, в результате сдвига рН в кислую сторону). О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке.
Отдельные бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты — протеазы, катализирующие расщепление белка
Для определения протеолитических ферментов — коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо-пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины. Например: возбудитель сибирской язвы образует кратерообразное разжижение МПЖ.
На практике о протеолитической активности бактерий чаще судят по способности расщеплять белок до продуктов глубокого распада: индола и сероводорода. Для этого исследуемую культуры засевают на МПБ. между пробкой и горлышком пробирки укрепляют индикаторные бумажки. На сероводород — индикаторная бумажка пропитана уксуснокислым свинцом (при выделении Н:8 — она чернеет), а на индол — индикаторная бумага пропитана раствором щавелевой кислоты (при выделении индола — она краснеет).
В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используется система индикаторная бумажная (СИБ) или мультимикротссты (ММТ).’
СИБ — набор бумажных дисков, пропитанных различными субстратами и индикаторами, которые помещают в пробирки с взвесью изучаемой культуры. ММТ — представляют собой пластиковые планшеты, в лунках которых находятся различные субстраты с индикаторами, на которые наносится взвесь изучаемой культуры. После суточного инкубирования в термостате по изменению цвета индикаторных дисков (при использовании СИБ) или содержимого лунок (при использовании ММТ) судят о биохимических свойствах культуры.
Пигментообразование является стойким генетическим признаком микроба и его цвет используется для идентификации пигментообразующих бактерий. Для большинства патогенных бактерий пигментообразование не характерно. Белый, золотистый, лимонно-желтый пигмент образуют стафилококки; желтый, кремовый — микобактерии туберкулеза; рубиново-красный – серрации; сине- зеленый — синегнойная палочка.
Пигменты, как правило, защищают микробную клетку от ультрафиолетовой радиации.
Характеристика бактериальных токсинов
Токсические вещества, синтезируемые бактериями, по своей химической природе относятся к белкам и липополисахаридам (ЛПС). Первые, как правило, секретируются живой бактериальной клеткой и поэтому получили название — экзотоксины. Вторые освобождаются после гибели клетки — эндотоксины.
Эндотоксины — ЛПС. Содержащиеся в клеточной стенке грамотрицательных бактерий. Токсические свойства эндотоксина определяются всей молекулой ЛПС. Эндотоксины в отличие от экзотоксинов более устойчивы к повышенной температуре, менее ядовиты, малоспецифичны, слабо иммуногенны.
Эндотоксины различных грамотрицательных микробов при введении в организм подопытных животных вызывают однотипную реакцию. При введении больших доз токсина у животных наблюдаются угнетение фагоцитоза и явления выраженного токсикоза (слабость, одышка, диарея, падение сердечной деятельности, понижение температуры тела). При введении небольших доз отмечается обратный эффект: стимуляция фагоцитоза, менее выраженный токсикоз, повышение температуры тела.
У людей поступление большого количества эндотоксина в кровяное русло приводит к токсико-септическому шоку. В результате чего наблюдается снижение артериального давления, как результат поступления повышенного количества серотонина и кининов в кровь, а также нарушение кровоснабжения органов и ацидоз. Действие эндотоксинов на клетки крови (гранулоциты, моноциты) приводит к лихорадке, так как из них выделяются эндогенные пирогены. Начало лихорадки совпадает с ранней лейкопенией, которая сменяется вторичным лейкоцитозом.
Некоторые бактерии способны одновременно синтезировать как эндотоксины, так и белковые токсины, например возбудитель холеры, чумы сальмонеллеза и др.
Белковые токсины — экзотоксины — в зависимости от связи со стромой бактериальной клетки, подразделяются на секретируемые, частично секретируемые и несекретируемые. Описано свыше 80 различных экзотоксинов, отличающихся друг от друга по молекулярной массе, химической структуре, «клеткам-мишеням» макроорганизма и биологической активности. Возможно, белковые токсины предназначены не только для поражения клеток, тканей и органов человека но и для участия в метаболических реакциях самих бактерий, их продуцентов.
По отношению к температуре различают: термолабильные и термостабильные белковые токсины. Так, например, термолабильный дифтерийный токсин разрушается при температуре 60 0С в течение 1 часа, а столбнячный — в течение 20 мин. Термостабильные токсины клостридий ботулизма, кишечной палочки, стафилококков могут переносить кратковременное кипячение.
Все экзотоксины состоят из двух составных частей. Одна — является рецептором и служит для фиксации молекулы токсина на соответствующей «клетке-мишени», вторая — собственно токсический фрагмент — проникает внутрь клетки, блокируя жизненно важные метаболические реакции.
Высокая токсичность белковых токсинов объясняется особенностью строения токсического фрагмента, имитирующего структуру гормонов, ферментов и нейромедиаторов макроорганизма. Это делает их антиметаболитами вышеупомянутых жизненно важных соединений, блокирующих функциональную активность последних.
Специфичность токсического действия экзотоксинов определяется избирательной фиксацией токсина на рецепторах «клеток-мишеней» определенных тканей (эпителиальной, нервной и др.) организма человека и животных. Различия в механизме действия данных токсинов позволили классифицировать среди них четыре группы, каждая из которых состоит из нескольких подгрупп (табл. 1).
Цитотоксины — блокируют синтез белка на субклеточном уровне. Например, антиэлонгаторы (дифтерийный гистотоксин, токсин синегнойной палочки и др.). выводят из строя фермент трансферазу II. ответственную за элонгацию (наращивание) полипептидной цепи на рибосомах.
К данной группе также относятся дермонекротоксины. поражающие клетки кожи и энтеротоксины. поражающие клетки слизистой кишечника.
Классификация основных групп белковых токсинов
| Тип | Группа, подфуппа | Возбудитель — продуцент |
| Цитотоксины | Антиэлонгаторы Энтеротоксины Дсрмонекротоксины | |
| Мембранотоксины | Лейкоцидины Гемоличины с фосфатида зной активностью О-стрептолизин. Пневмоличин А-токсин Тетанолизин | |
| Функциональные блокаторы | Термостабильныс Энтеротоксины. Термолабильные энтеротоксины. Холероген Токсиблакаторы «мышиные» токсины Коклюшный стимулирующий фактор Нуйротоксины | |
| Эксфолиатины, эритрогенины | Эксфолиатины Эритрогенины |
Вторая группа — «мембранотоксины» — повышают проницаемость мембраны эритроцитов (гемолизины) и лейкоцитов (лейкоцидины), вызывая их гибель.
Третья группа — «функциональные блокаторы» — включает термолабильные и термостабильные энтеротоксины. активизирующие клеточную аденилатциклазу, приводя к повышению проницаемости стенки тонкой кишки и увеличению выхода жидкости в ее просвет — диарее. Эта группа включает, например, холероген, продуцируемый холерным вибрионом, термолабильные энтеротоксины кишечной палочки и других энтеробактерий.
Токсикоблокаторы. «мышиные» токсины, вырабатываемые сибиреязвенной и чумной палочками, в отличие от энтеротоксинов инактивируют аденилатциклазу, являясь антагонистами данного фермента.
Нейротоксины (тетаноспазмин, ботулинический токсин) блокируют передачу нервных импульсов в клетках спинного и головного мозга.
Четвертая группа — эксфолиатины (продуцируемые золотистым стафилококком) и эритрогенины (образуемые скарлатинозным стрептококком), влияют на процессы межклеточного взаимодействия.
Экзотоксины обладают высокой иммуногенностью, что проявляется в способности вызывать иммунный ответ со стороны макроорганизма, в частности индуцировать синтез специфических антител — антитоксинов, нейтрализующих гомологичный токсин.
Ряд белковых токсинов, например столбнячный, дифтерийный, ботулинистический, гангренозный и др., под действием формалина утрачивают свою ядовитость, сохраняя при этом иммуногенные свойства. Такие токсины получили название — анатоксинов. Они применяются в качестве вакцин для профилактики одноименных заболеваний. Например, вакцина АКДС, содержащая столбнячный и дифтерийный анатоксины.
Многие бактерии (стафилококки, стрептококки и др.) образуют не один, а несколько белковых токсинов, обладающих разным действием.
Токсигенность бактерий изучают в опытах на чувствительных лабораторных животных
Практическая часть занятия
Цель занятия:
- изучить методы культивирования и выделения чистых ку льту р анаэробных бактерий;
- изучить биохимические свойства бактерий и методами их определения.
Мотивационная характеристика темы:
Изучение биохимических свойств бактерий наряду с определением морфологических, тинкториальных и культуральных свойств позволяет идентифицировать микроб и установить его роль в качестве возбудителя инфекционного заболевания.
Студент должензнать:
- классификацию микроорганизмов по способу дыхания
- методы культивирования анаэробов
- основные методы выделения чистых культур анаэробов
- основные тесты, характеризующие биохимические свойства микробов
Студент должен уметь:
- выделять чистую культуру бактерий;
- должен уметь идентифицировать выделенную культуру по морфологическим, тинкториальным, культурным и биохимическим свойствам.
Студент должен иметь навыки:
- соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности в бактериологических лабораториях:
- обеззараживания инфицированного материала, антисептической обработки рук, контаминнрованных исследуемым материалом:
- стерилизации бактериальных петель прокаливанием;
- посева и пересева исследуемого материала на питательные среды;
- идентификации изучаемой культуры по биохимическим тестам.
Оснащение занятия:
На группу:
1. Таблицы: «Выделение чистой культуры анаэробов», «Методы культивирования анаэробов».
2. Таблицы: «Биохимические свойства бактерий», «Ферментативная активность бактерий кишечно-тифозной группы», «Токсины бактерий».
3. Анаэростат, эксикатор.
4. Демонстрация роста анаэробов на среде Китта-Тароцци
5. Демонстрация сахаролитических и протеолитических свойств кишечной палочки на средах Гисса.
На рабочее место:
1. Микроскоп.
2. Посевы исследуемого материала (прошлого практического занятия) на чашках Петри с МПА.
3. Пробирка со скошенным агаром.
4. Чистая культура грамотрицательной палочки на скошенном агаре.
5. Пробирки со средами Гисса: глюкозой, лактозой, сахарозой.
6. Пробирка с МПБ.
7. Индикаторные бумажки на индол и сероводород.
8. Пинцет, бактериологическая петля.
9. Спички, карандаш по стеклу.
10. Спиртовка.
11. Набор для окраски по методу Г рама.
12. Пробирка с физраствором.
13. Предметные стекла.
14. Пробирка с исследуемым материалом на обнаружение анаэробов.
15. Пробирка со средой Китта-Тароцци.
16. Банка с дезраствором.
1. Продолжить протокол №1 по выделению чистой культуры аэробных бактерий:
а) изучить посевы на чашке с МПА;
б) отобрать подозрительную колонию и описать ее;
в) приготовить из колонии мазок, окрасить по Граму и промикроскопировать.
г) отсеять подозрительную колонию на скошенный агар.
д) результаты внести в протокол.
2. Изучить биохимические свойствами микроорганизмов по таблицам и демонстрационным материалам.
3. С целью идентификации чистой культуры грамотрицательной палочки определить:
а) сахаролитические свойства, сделав посев на среды Гисса (с глюкозой, лактозой, сахарозой);
б) протеолитические свойства, сделать посев на МПБ и внети в пробирку индикаторные бумажки на сероводород и индол;
в) ход исследования оформить в виде протокола №2.
4. Ознакомиться с методами культивирования анаэробных бактерий по таблицам и демонстрационным материалам.
5. Провести посев исследуемого материала на среду Китта-Тароцци для выделения анаэробных бактерий. Ход исследования оформить в виде протокола №3.
Протокол №1
