Мастнокжлое брожение вызывается облигатно-анабэробными маслянокислыми бактериями и представляет распад сахара на масляную кислоту и газы с высвобождением энергии.
Химизм :
О 6Н12О6 = СН 3СН2 СНз СООН + 2 С03 + 2 Н2 + Q ккал.
масляная кислота
Схема :
1. С6Н12О6 = 2 СН зСОСООН + 2 Н2
пировиноградная кислота
2. 2 СНз СОСООН = 2 СНз — СНО + 2 С02
уксусный альдегид
3. СНз СНО + НСН2СНО = СН 3СНОНСН 2СНО
альдоль
4. СНз СНОНСН2 СНО — СН3 СН2 СН2 СООН
масляная кислота
Проведение задания.
1. Приготовить накопительную культуру .
2. Прокипятить исследуемую почву в колбе в небольшом количестве питательной среды для уничтожения неспороносных форм бактерий .
3. Поместить накопительную культуру в термостат .
4. Изучить состав и зарисовать возбудителей маслянокислого брожения .
5. Изучить химизм процесса.
Приготовить накопительную культуру м.о.
| вещество | потребное кол-во |
| бобовый бульон | 2,0 |
| крахмал | 0,5 |
| пептон | 0,5 |
| натрий хлор | 0,5 |
| мел | 2,0 |
В колбу емкостью 150 мл. вносят почву 1\ 2 чайной ложки , наливают 30-50 мл. приготовленной среды и кипятят 10 мин. на электроплите для уничтожения бесспоровых форм бактерий . После кипячения доливают питательной средой до верху и закрывают плотно пробкой с газоотводной трубкой , которую погружают в пробирку с водой ( изоляция культуры от воздуха ). Помещают в термостат при 25 0 С на 7-10 суток . На 3-5 сутки начинается газообразование и появляется запах масляной кислоты. Для микроскопирования жидкость из колбы с накопительной культурой берут так : погружают пипетку в колбу в нижний слой жидкости и набирают несколько капель , переносят пробу на предметное стекло .
При микроскопирования следует добавлять в препарат 1-2 капли раствора Люголя , так как клетки этой группы м.о. богаты гранулезой , дающей с йодом синее окрашивание.
При мнкроскопировании возбудителей маслянокислого брожения углеводов отыскивают Clostridium pasteurianum вегетативную и спорообразующую форму .
Вегетативная форма – крупная, подвижная палочка со слегка заостренными кончиками. Спорообразующая J имеет форму веретена . Споры цилиндрические . Другие возбудители маслянокислого брожения имеют форму барабанной палочки .
Вопросы для самопроверки.
1. Что такое молочнокислое брожение?
2. Напишите уравнение 2 типов молочнокислого брожения, охарактеризуйте возбудителей этих процессов.
3. Напишите уравнение маслянокислого брожения, назовите и охарактеризуйте их возбудителей .
4. Что такое «верховое» и «низовое» брожение?
5. При какой температуре идут эти процессы ?
6. Химизм спиртового брожения .
7. Что из себя представляют дрожжи рода сахаромицеты ?
8. Как готовят накопительную культуру маслянокислых м.о. ?
9. Как обнаружить наличие масляной кислоты в накопительной культуре ?
10.Как приготовить накопительную культуру молочнокислых м.о. ?
11. Где нашло применение спиртовое , молочное и маслянокислые брожения ?
Домашнее задание:
5. Оформление отчета по лабораторному занятию.
6. Подготовиться к защите лабораторного занятия.
Лабораторная работа № 9
Возбудители гниения и их культивирование (картофельная палочка, сенная палочка, палочка Протея и др.)
Учебная цель работы: Изучить микроорганизмы. вызывающие гниение белковых ве ществ , методику их культивирования.
Материальное обеспечение:
1. Микроскоп 1 шт.
2. Краски по Грамму 1 экз.
3. Микробиологическая петля 1 шт.
4. Спиртовка 1 шт.
5. Двойной флакон для иммерсионного масла и бензина 1 шт.
6. Этиловый спирт 1 флакон
7. Песочные часы 1 шт.
8. Накопительные культуры гнилостных микроорганизмов
9. Питательная среда состава: мясной бульон , 0,5 % NaCl, 3 % пептон
10.Колба Эрленмейерана 50 мл. 1 шт.
11.Фильтровальная бумага, смоченная раствором уксусного свинца
12.Индикаторная бумага — красный лакмус 1 шт.
13.Почва 5 г.
14. Ватная пробка для колбы 1 шт.
15.Предметные стекла
Организация и методика выполнения работы .
Накопительная культура гнилостных (аммонифицирующих ) микроорганизмов готовят следующим образом : в колбу Эрленмейера на 50 мл. наливают 30 мл. питательной среды и заражают почву , на края колбы подвешивают смоченную водой лакмусовую бумагу и фильтровальную бумагу смоченную уксуснокислым свинцом , закрывают пробкой и термостатнруют 5-7 суток при температуре 22 — 25° С . После термостатирования отмечают изменения в окраске индикаторной бумажки . Для изучения возбудителей каплю сброженной жидкости наносят на предметное стекло , фиксируют , красят по Граму , микроскопируют с иммерсией при увеличении объективов х 90 . В препарате разыскивают н зарисовывают 3 группы аммонифицирующих бактерий : аэробные Bacillus subtilis , Вас. Mycoides ; факультативно анаэробные Bact. coli , Proteus vulgaris ; анаэробные Clostridium putrificum . Препарат зарисовать .
Накопительную культуру картофельной палочки готовят так : картофель очищают от кожуры , режут кубиками , натирают мелом , помещают в чашки Петри и заливают стерильной водой , термостатнруют при температуре 37 С в течение 24 часа Для изучения возбудителей . каплю жидкости стерильной петлей наносят на поверхность предметного стекла „ фиксируют , окрашивают по Граму , микроскопируют объективом х 90 , зарисовывают .
Bacillus mesentericus культивируют на мышечной ткани белка животного или рыбы . Кусочки мяса животных или рыбы помещают в пробирку колбу „ заливают водой и термостатируют при температуре 37°С , в течение 24 часов .
Культуру микроорганизмов фиксируют и окрашивают по Граму микроскопируют с объективом х 90 , зарисовывают , делают вывод какие из них являются грамположительными , а какие грамотрицательными .
1. Аэробные гнилостные микробы :
Вас. Mycoides — почвенная бактерия . Небольшая (1,6 — 3,5 мм.) , грамположительная палочка , дающая споры овальной формы разной величины , перитрихи . На твердых питательных средах образуют характерные колонии , напоминающие мицелий (грибовидный).
Bacillus mesentericus — картофельная палочка . Очень близка по форме предыдущей бактерии , образует крупные споры устойчивые к высоким температурам . Размеры (1,5-5 мм.), грамположительная, дающая цепочки из бактерий , перитрихи.
Bacillus subtilis — сенная палочка . Вызывает аммонификацию белка . Короткая подвижная палочка с округленными концами . Образует овальные споры . Грамположительная.
2. Факультативно — анаэробные гнилостные микробы :
Proteus vulgaris — вульгарный протей , полиморфна т.е. резко изменяет форму и размеры при развитии на питательных средах различного состава . Бесспоровая палочка , перитрихи .Длина клеток ( 1,6 — 4 м. ) при разложении белка создает сильнощелочную реакцию и образует сероводород и индол , а при сбраживании углеводов вызывает их сбраживание с образованием газов СО , Н и органических кислот. Грамогрицательная.
Bact. coli — кишечная палочка , подвижная , бесспоровая , грамотрицательная . Принимает участие в разложении белка . Встречается в составе микрофлоры кишечника человека и животных.
3. Анаэробные гнилостные микробы :
Clostridium putrificum — грамположительная спороносная палочка ( вид барабанной палочки ). Углеводы не сбраживает , а белки разлагает с образованием большого количества газов.
Clostridium sporogenes — сбраживает углеводы , маленькая палочка , спорообразующая.
Вопросы для самоконтроля.
1. Что такое гниение?
2. Какие микроорганизмы вызывают гниение белковых веществ 9
3. Какое значение имеет гниение в природе и пищевой промышленности ?
4. Какие конечные продукты образуются в результате гниения ?
5. Как готовится накопительная культура аммонифицирующих м.о. ?
6. Назовите аэробные аммонифицирующие м.о. ?
7. Назовите факультативно-анаэробные аммонифицирующие м.о. ?
8. Какие вы знаете строгие анаэробы ?
9. Дать характеристику картофельной , сенной и кишечной палочкам 9
10.Какую температуру выдерживают строгие анаэробы ?
7. Оформление отчета по лабораторному занятию.
8. Подготовиться к защите лабораторного занятия.
Лабораторная работа № 10
Посев микроорганизмов почвы, воздуха и воды
для санитарно-бактериального исследования.
Учебная цель работы: привить навыки определения санитарно-бактериологических показателей воды, микробным числом, коли-титром, коди-индексом . Привить навыки определения микробного числа воздуха , определения микрофлоры почвы.
Материальное обеспечение:стерильный расплавленный МПА; стерильные пипетки на 1 мл; чашки Петри; чашки Петри со средой Эндо; пробирки со стерильными средами Гисса с мальтозой; мембранные ультрафильтры № 3; химические стаканы; предметные стела; покровные стекла; пинцеты; дистиллированная вода; фильтр Зейтца; насос Камовского; пробы воды; микроскоп; набор красителей для окраски по Грамму; бактериологические петля; иммерсионное масло; горелки; спирт; спиртовки; стерильный цилиндр; вата; водяная баня; песочные часы (на 1, 2, 3 мин.); тех. весы с разновесами; метаялические петли; почва; агар бобово-пептонный слабощелочной или МПА простерилизованный в пробирках; ножницы; этикетки.
Санитарно-бактериологический анализ воды включает в себя определение микробного числа воды, титра-Coli, индекса- Coli.
Микробное число воды — количество колоний микроорганизмов вырастающее при посеве 1 мл воды за 24 часа при температуре 200С.
Микробное число воды дня водопроводной воды не должно превышать 100, а для воды колодцев и артезианских скважин допускается до 1000.
Определение микробного числа воды
Начинают с приготовления нужного разведения. Пробу воды тщательно перемешивают, стараясь не замочить пробку, после чего стерильной пипеткой отбирают требуемое количество воды 1 или 0,1 мл. воды высевают непосредственно в чашках Петри без разведения. Для засева меньших количеств воды (если предполагается большая загрязненность) ее предварительно разводят стерильной водопроводной водой. Из каждой пробы употребляют для посева не менее 2 различных разведений. Воду вносят в стерильную чашку Петри, затем выпивают 20 мл. расплавленного и остуженного до 37° С стерильного МПА. Вращательным движением осторожно смешивают ровным слоем по чашке с водой и распределяют. На крышке чашки делают подробную запись о пробе и после застывания агара ее помещают в термостат при 370 С предварительно перевернув чашку Петри вверх дном. Пробы воды из водоемов вначале выращивают при температуре 20 С 48 часов.
