Определение активности каталазы

Содержание

Наименование лабораторных тем Количество часов
Культивирование микроорганизмов поверхностным способом на твердых питательных средах.
Экстрагирование ферментов, выращенных поверхностным способом
Культивирование микроорганизмов глубинным способом
Определение активности каталазы
Колориметрический метод определения активности ?- и ?-амилазы
Определение активности солодовых амилаз.
Подготовка ферментного препарата и обработка мезги
Определение сыропригодности молока сычужной пробой
Определение бактериальной обсемененности молока
Исследование влияние тепловой обработки на свойства молока.
ИТОГО:


Ферменты

Ферменты — биологические катализаторы белковой природы, образуемые любой живой клеткой и обладающие способностью активизировать различные химические соединения.

Механизм действия ферментов, как и всех других катализаторов, связан со снижением энергии активации, необходимой для прохождения химической реакции, направляя ее обходным путем через промежуточные реакции, которые требуют значительно меньшей энергии активации. Так, реакция АВ А + В в присутствии фермента идет следующим образом: АВ+ФАВФ; АВФА+ВФ; ВФВ+Ф.

Все ферменты разделяют на два большие класса: однокомпонентные и двухкомпонентные.

К первому классу относятся ферменты, состоящие только из белка, обладающего каталитическими свойствами, а ко второму классу — ферменты, которые состоят из белка и связанной с ним небелковой части, так называемой активной группой. Для названия активных групп двухкомпонентных ферментов часто используют термин кофермент, или простетическая группа. У однокомпонентных ферментов роль активных групп выполняют определенные химические группировки, входящие в белок. Эти группировки получили название активных или каталитических центров.

Одним из свойств ферментов, отличающихся от свойств неорганических катализаторов, является их большая лабильность — зависимость от ряда воздействий: концентрации водородных ионов, температуры, окислительно-восстановительных условий, концентрации некоторых соединений (продуктов обмена веществ), ионов металлов и т.п.

Вторая весьма существенная особенность каталитического действия ферментов состоит в том, что оно строго специфично, то есть действие ферментов направлено на совершенно определенные химические связи.

По характеру своего каталитического воздействия ферменты разделяются на шесть классов:

1) оксидоредуктазы или окислительно-восстановительные ферменты;

2) трансферазы, т.е. ферменты, катализирующие перенос различных групп атомов с одной молекулы на другую;

3) гидролазы, катализирующие гидролитические реакции;

4) лиазы — ферменты, которые отщепляют от субстратов ту или иную группу (не путем гидролиза) с образованием двойной связи или наоборот, присоединяют к двойным связям;

5) изомеразы, т.е. ферменты, катализирующие реакции изомеризации органических соединении;

6) лигазы или синтетазы — к этому классу принадлежат ферменты, которые катализируют синтетические реакции.

Каждый из этих классов подразделяется на подклассы, а эти последние, в свою очередь, на более мелкие группы.

На всех этапах переработки зерна в муку, в процессе его хранения, а также при приготовлении теста и выпечке хлеба, в большей или меньшей степени проявляется активность гидролитических и окислительных ферментов, оказывающих существенное влияние на качество продукта.

В зерне ферменты содержатся в тканях зародыша, алейронового слоя и эндосперма. Это характерные для живых растительных клеток ферменты, обуславливающие специфические функции в процессах обмена веществ.

Из множества ферментов, обнаруженных в зерне злаков, обстоятельному изучению подверглись лишь те, которые оказывают или могут оказать воздействие на качество продуктов переработки зерна. К ним относятся амилазы, протеазы, липазы, липоксигеназы, полифенолоксидазы и др. Наряду с этим было установлено, что некоторые ферменты зерна могут являться хорошими индикаторами его физиологического состояния. Так, каталаза, являясь очень термолабильной, хорошо отражает понижение всхожести при сушке семенного зерна, и ее активность может служить индикатором для контроля процесса сушки.

Исключительно велико биологическое значение амилаз при созревании и прорастании зерна, а также в ряде технологических процессов пищевых производств, имеющих в своей основе гидролитические превращения крахмала под влиянием амилаз зерна.

В зерне злаковых культур содержится два специфических фермента, обусловливающих гидролиз крахмала, а именно:

1) -1,4 — глюкангидролаза или ??-амилаза, гидролизующая ?-1,4 — глюкановые связи крахмала и родственных ему полисахаридов, причем эти связи разрываются беспорядочно;

2) -1,4 – глюканмальтогидролаза или ?? – амилаза, гидролизующая ?-1,4 – глюкановые связи в полисахаридах, последовательно отщепляя остатки мальтозы от нередуцирующих концов цепей.

Несмотря на то, что протеазы имеют не менее важное значение для технологии, они изучены значительно меньше, чем амилазы. Причина этого заключается в том, что классические методы изучения протеаз животного происхождения (ферментов, гидролизующих белки) оказались малоэффективными при изучении протеолитических ферментов зерна злаков. Под влиянием протеаз происходят разжижение клейковины, что, в свою очередь, приводит к ухудшению качества выпекаемого хлеба.

Липазы вызывают гидролиз жиров, т.е. расщепляют сложные эфиры глицерина с образованием свободных жирных кислот, в результате чего повышается кислотность зерна и муки.

При участии липоксигеназ происходит окисление непредельных жирных кислот, образуются низкомолекулярные карбонильные и карбоксильные соединения, обладающие неприятным запахом и горьковатым вкусом. Этот процесс называют прогорканием жиров (муки).

Лабораторная работа №1.

Тема: Культивирование микроорганизмов поверхностным способом на твердых питательных средах.

Цель работы: Выращивание продуцентов различных ферментов на твердых сыпучих средах и проведение анализа полученных культур на активность содержащихся в них ферментов.

Метод поверхностных культур. Поверхностное культивирование аэробов проводят на плотной или сыпучей среде, а также в тонком слое жидкой среды в стеклянной посуде с широким дном: чашках Петри, колбах Виноградского, матрацах, кюветах. Засеянные сосуды выращивают при постоянной температуре в термостатах или термостатных комнатах (термокамерах). Микроорганизмы развиваются на поверхности среды и используют кислород непосредственно из воздуха. На жидких средах облигатные аэробы растут в виде обильных пленок. Факультативные аэробы (анаэробы) развиваются как в толще жидкой среды, образуя суспензии, хлопья, осадок, так и на поверхности в виде тонкой пленки. На плотных средах микроорганизмы растут в виде отдельных колонии или сплошным газоном. Поверхностное культивирование в лабораторных условиях широко применяют для получения накопительных и чистых культур, их хранения, изучения морфологических, культуральных и биохимических признаков микроорганизмов. В промышленности метод поверхностных культур на жидких средах используют для получения лимонной кислоты, на сыпучих – для производства ферментных препаратов.

В данной лабораторной работе удобнее всего использовать микроскопические грибы или дрожжеподобные микроорганизмы, например такие, как Asp niger. Rh. Delemar и др.

Методические рекомендации по проведению работ и обработке экспериментальных данных:

1.Подготовка посуды и ее стерилизация;

2.Приготовление питательной среды и ее стерилизация;

3.Расчет количества воды, необходимой для увлажнения питательной среды;

4.Увлажнение стерильной питательной среды, ее засев и раскладка в кюветы для выращивания;

1.Подготовка посуды к стерилизации. Вся посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и высушена в сушильном шкафу.

Для стерилизации следует завернуть в бумагу, и аккуратно завязать веревочками следующие предметы: кювету, крышку к кювете.

Стерилизацию посуды и воды следует проводить в автоклаве при температуре 120ºС в течение 0,5 ч.

Стерильная посуда после автокловирования должна быть подсушена в сушильном шкафу при 105 ºС , так как бумага при стерилизации слегка увлажняется.

2. Приготовление и стерилизация питательной среды. Для каждого микроорганизма готовится своя питательная среда, обеспечивающих биосинтез определенных ферментов.Среда для каждой кюветы стерилизуется отдельно. Приготовленная среда помещается либо в пакет, либо многослойную салфетку из марли, либо в широкий стеклянный стакан. Для Asp. oryzae, например, используется следующие варианты питательных сред: пшеничных отрубей-100,70; солодовых ростков-30; свекловичного жома-50; выжимок винограда-20; солодовых ростков-50; рисовой шелухи-50.

3. Для нормального развития микроскопического гриба и интенсивного образования ферментов необходимо, чтобы среда имела влажность 58-63%.

Расчет количества добавляемой воды проводится по следующим данным:

Acp- масса питательной среды с исходной влажностью;

Вср- содержание абсолютно сухого вещества в исходной пробе;

Сср- масса питательной среды с требуемой влажностью;

Гср- масса питательной среды после стерилизации;

Д- количество воды, которое необходимо добавить для получения питательной среды требуемой влажности.

Лабораторная работа №2

Тема: Экстрагирование ферментов, выращенных поверхностным способом

Цель работы: Уметь культивировать микроорганизмов поверхностным способом на твердых питательных средах.

Метод экстрагирования поверхностных культур. Поверхностное культивирование аэробов проводят на плотной или сыпучей среде, а также в тонком слое жидкой среды в стеклянной посуде с широким дном: чашках Петри, колбах Виноградского, матрацах, кюветах. Засеянные сосуды выращивают при постоянной температуре в термостатах или термостатных комнатах (термокамерах). Микроорганизмы развиваются на поверхности среды и используют кислороднепосредственно из воздуха. На жидких средах облигатные аэробы растут в виде обильных пленок. Факультативные аэробы(анаэробы) развиваются как в толще жидкой среды, образуя суспензии, хлопья, осадок, так и на поверхности в виде тонкой пленки. На плотных средах микроорганизмы растут в виде отдельных колонии или сплошным газоном. Поверхностное культивирование в лабораторных условиях широко применяют для получения накопительных и чистых культур, их хранения, изучения морфологических, культуральных и биохимических признаков микроорганизмов. В промышленности метод поверхностных культур на жидких средах используют для получения лимонной кислоты, на сыпучих- для производства ферментных препаратов.

В данной лабораторной работе удобнее всего использовать микроскопические грибы или дрожжеподобные микроорганизмы, например такие, как Asp niger. Rh. Delemar и др.

Методические рекомендации по проведению работ и обработке экспериментальных данных:

Лабораторная работа №3

Тема: Культивирование микроорганизмов глубинным способом.

Цель работы: Уметь культивировать микроорганизмов глубинным способом.

Глубинное культивирование. Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным. При периодическом процессе весь объем питательной среды засевают посевным материалом и выращивание ведут в оптималных условиях определенный промежуток времени, пока не накопится нужное количество биомассы или целевого продукта. Для обеспечения роста аэробных культур в глубоких слоях жидкости необходимо поступление кислорода. Так как микробные клетки способны использовать только растворенный кислород, а растворимость его невелика(4-7 мг/г)

Простым и доступным способом периодического глубинного культивирования является выращивание аэробных культур в суспендированном состоянии в жидкой среде, разлитой в небольших объемах в пробирки и колбы.

Непрерывное глубинное культивирование ведут в лабораторных ферментаторах. Процесс непрерывного выращивания в ферментаторе осуществляется по типу хемостата или турбидостата.

Целью настоящей работы является выращивание продуцентов различных ферментов на жидких питательных средах глубинным способом и анализ получаемых культур микроорганизмов на содержание в них определенных ферментов.

Как в первой лабораторной работе необходимо полуичть посевной материал, который готовят, выращивая продуцент в несколько пассажей на агаризованных средах в пробирках или матрацах.

В лабораторной работе студент готовит 0,7дм3 питательной среды. Первоначально на технических весах взвешивается стакан, а затем в стакан отвешиваются все необходимые компоненты среды. Жидкие компоненты среды отмериваются по объему.

Соли растворяются без особых предосторожностей. Крахмал или мука смешиваются в соотношении 1:10 с холодной водой и завариваются на кипящей водяной бане.

Варианты питательных сред для культивирования микроорганизмов- продуцентов ферментов.

Таблица 1

Компоненты питательной среды Варианты питательных сред и содержание компонентов,%
Asp. Oryzae 0,3
Кукурузный экстракт 0,3 0,4 2,0
Соевая мука 0,5 4,0 2,0
Кукурузная мука 2,0 0,5
Кормовые дрожжи 0,2
Карбонат кальция 0,1 0,2
Ash. bitatаe 1,0
Фильтрат полеспиртовой барды 98,3 96,8
Кукурузный крахмал 1,5 0,2
Технический магнезит 0,2 0,2 1,5
Ржаная мука 2,5 1,0
Кукурузный экстракт 0,2 0,5 1,0

Для каждого варианта берут по четыре колбы, в каждую наливают по 120 см3 приготовленной среды. Колбы закрывают ватными пробками, пробки прикрывают бумажными плотными колпаками, чтобы онине увлажнялись при стерилизации. Одновременно с качалочными колбами на стерилизацию ставят колбу с 50 см3 среды для последующего определения ее рН.

Определения рН среды

рН среды определяют электрометрическим методом дважды: до и после стерилизации, осуществляется каждый раз по три повторности этих определений и анализируя затем достоверность этих результатов.

Засев питательной среды

После того как стерилизация окончена и автоклав открыт, пипетки помещают на 10-15 мин. В горячий сушильный шкаф для подсушивания бумаги, колбы и остальные посуды оставляют в автоклаве на 10-15 мин. Засев питательной среды проводят в боксе.

Лабораторная работа №4

Определение активности каталазы

Каталаза относится к первому классу ферментов (оксидоредуктаз) и катализирует реакцию разложения перекиси водорода на воду и кислород по уравнению:

Каталаза играет важную роль в жизнедеятельности организмов, так как она разрушает ядовитую для клеток перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания.

Количественное определение каталазы основано на учете перекиси водорода путем титрования ее перманганатом калия. Реакция идет по уравнению:

2KMnO4 + 5H2O2 + 4H2SO4 2KHSO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 5O2

О количестве перекиси водорода, разрушенной ферментом, судят по разности количеств 0,1 моль/дм3 раствора КМnО4, израсходованных на титрование в контрольном и рабочем опытах.

Испытуемый материал: солод (проросшее зерно)

Реактивы: раствор перекиси водорода ? (H2O2) = 1 %

раствор серной кислоты ? (H2SO4) = 10 %

раствор перманганата калия С (1/5 KMnO4) = 0,1 моль/дм3

5 г испытуемого материала настаивают при комнатной температуре в течение 30 минут со 100 см3 воды, периодически перемешивая содержимое колбы. После настаивания жидкость отфильтровывают через сухой складчатый фильтр и из прозрачного раствора отбирают пипеткой две порции по 20 см3 (одна опытная и одна контрольная) и переносят каждую в отдельную коническую колбу на 200 см3. Контрольную кипятят 3 мин для инактивации фермента.

К опытной и контрольной пробам прибавляют по 20 см3 дистил-лированной воды, по 4 см3 перекиси водорода, и оставляют на 20 мин при комнатной температуре для действия фермента. По истечении 20 мин к пробам прибавляют по 5 см3 серной кислоты, и оставшуюся (не разложившуюся) перекись водорода титруют раствором перманганата калия.

Активность каталазы выражают в микромолях перекиси водорода, разложившейся под действием фермента за 1 мин в расчете на 1 г исследуемого материала.

Активность каталазы определяют по формуле:

Определение активности каталазы

где Х – активность каталазы;

а — количество 0,1 моль/дм3 раствора KMnO4, израсходованного на титрование контрольного раствора, см3;

b — количество 0,1 моль/дм3 раствора KMnO4, израсходованного на титрование опытного раствора, см3;

К – поправка к титру;

100 – общий объем экстракта, см3;

50 – коэффициент пересчета на микромоли H2O2 ;

20 – объем ферментного раствора, см3;

20 – время ферментативной реакции, мин;

Р — навеска испытуемого материала, взятого для анализа, г.

Лабораторная работа №5.

Колориметрический метод определения активности ?- и ?-амилазы

Под действием амилаз в растениях происходит гидролиз высоко-полимерного углевода — крахмала — с образованием декстринов и мальтозы. В растениях встречаются ?- и ?-амилазы.

Раздельное количественное определение активности ?- и ?-амилаз основано на их различной термостабильности: ?-амилаза разрушается нагреванием до 70 °С, ? -амилаза при этом сохраняет свою активность.

Методы определения активности амилазы основаны либо на учете количества сахара, образовавшегося при действии фермента на крахмал, либо на учете количества нерасщепленного ферментом крахмала, которое определяют фотометрически после обработки раствором иода.

Реактивы: ацетатный буфер с рН 5,5;

раствор хлорида натрия ? ( NаСl ) =1 %;

раствор крахмала ? = 10 % , (2 г крахмала, размешанного в 20 см3 холодной воды, выливают в 80 см3 кипящей воды, после чего нагревают на кипящей водяной бане до просветления раствора);

раствор соляной кислоты С(HCl) =1 моль/дм3

раствор соляной кислоты С(HCl) =0,1 моль/дм3

раствор йода ? = 0,3 % в 3 %-ном растворе йодистого калия.

Навеску 0,5 — 1 г муки или проростков растирают в ступке с небольшим количеством 1 %-ного раствора NаСl и переносят в коническую колбу на 50 см3. Соотношение между навеской и раствором NаСl 1:10 или 1:20. Содержимое колбы хорошо перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре в течение 30 мин, периодически встряхивая. Затем фильтруют через плотный складчатый фильтр. При трудном фильтровании можно сочетать фильтрование и центрифугирование при 4000-5000 об/мин. Прозрачный раствор используют как ферментный препарат.

Для определения активности ?- и ?-амилазы берут 4 пробирки (2 опытные и 2 контрольные) и вносят в них по 3 см3 ацетатного буфера и 3 см3 2%-ного раствора крахмала. Смесь нагревают на водяной бане или в термостате до 40°С. Затем в опытные пробирки вносят по 0,2—1,0 см3 ферментного препарата (в зависимости от активности амилаз в объекте изучения), а в контрольные — такое же количество Н2О. Содержимое пробирок перемешивают и ставят в термостат при 40 °С на 30 или 60 мин. После инкубации в каждую пробирку сразу приливают по 2 см3 1 н. раствора НСl для прекращения действия амилаз.

Для выявления непрореагировавшего с ферментом крахмала проводят реакцию с йодом. В мерные колбы на 50 см3 приливают около 30 см3 воды, 1 см3 0,1 н. НСl, 5 капель 0,3 %-го раствора иода и вносят из каждой пробирки по 0,5 см3 смеси. Содержимое колб хорошо перемешивают, доводят до метки водой и колориметрируют на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре или на спектрофотометре при 595 нм в кювете с рабочей длиной 1 см.

Для определения активности ?-амилазы в коническую колбу на 100 см3 приливают 5 см3 фильтрата (ферментного препарата), добавляют на кончике ножа сухого уксуснокислого кальция и выдерживают в течение 15 мин в ультратермостате или на водяной бане при 70°С (допускаются колебания температуры не более 0,5°С). Затем содержимое колбы быстро охлаждают в сосуде с холодной водой. При таком прогревании ? -амилаза полностью инактивируется, а ?-амилаза сохраняет свою активность. Далее определение ? -амилазной активности сводится к описанной выше процедуре.

Действие обоих ферментов выражают в миллиграммах гидролизованного крахмала в условиях опыта (за 30 мин или 1 ч) на 1 г муки (проростков). Активность ?-амилазы определяют по разности между суммарной активностью ?- и ?-амилаз и активностью ?-амилазы. Активность амилаз на 1 г муки за 1 ч рассчитывают по следующей формуле:

Определение активности каталазы

где D — оптическая плотность контрольного раствора;

D1 — оптическая плотность опытного раствора;

а — количество внесенного крахмала (60 мг);

m — масса навески, г;

V — объем исходной ферментной вытяжки, см3

V1 — объем вытяжки, взятой для инкубирования, см3.

Лабораторная работа № 6

Определение активности ферментов, лекция


Похожие статьи.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями: