1. Выделение чистой культуры является основой бактериологической работы, т.к. в практической деятельности приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микробов (гной, испражнения и т.д.), идентификация же вида возможна только тогда, когда бактерии получены в чистом, изолированном виде.
2. Для получения чистой культуры необходимо отделить бактериальные клетки разных видов друг от друга. По способу их отделения различают две основные группы методов выделения чистых культур: а) методы, основанные на механическом разделении; б) методы основанные на различиях в биологических свойствах микроорганизмов.
3. Чаще всего используются механические способы разъединения бактериальных клеток – специальные методы посева:
а) рассев шпателем по Дригальскому: берут три чашки Петри с питательным агаром; на первую чашку наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности агара; затем шпатель переносят во вторую чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды; аналогичным образом производят посев шпателем и в третьей чашке. На первой чашке вырастает максимальное количество колоний; на третьей – минимальное, где вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры;
б) рассев петлей (штрихами или сеткой): берут одну чашку Петри с питательным агаром; петлей на небольшом участке питательного агара делают сплошной посев исследуемого материала, а затем, отступив от засеянной площадки, делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим количеством клеток вырастут отдельные колонии;
в) фильтрация: исследуемый материал пропускают через специальные фильтры с определенным диаметром пор и таким образом разделяют микроорганизмы по величине (в основном применяется для очистки вирусов от бактерий).
Т.о., при помощи специальных методов посева добиваются роста микроорганизмов на плотных питательных средах в виде изолированных колоний различных видов бактерий, содержащихся в исходном материале в виде смеси, т.е. получают чистую культуру из одной клетки, а далее осуществляют ее пересев.
4. Биологические способы выделения основаны на различиях в биологических свойствах микроорганизмов:
а) метод Шукевича – исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, подвижные формы микробов при размножении как бы вползают на поверхность агара из конденсационной воды (Proteus vulgaris), отсевая верхние края культуры в воду свежескошенного агара, и, повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру;
б) метод прогревания – прогревают материал при 80° С на водяной бане 10-15 минут, при этом вегетативные формы погибают, а споры остаются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают (этот метод позволяет отделить споровые формы от неспоровых);
в) бактериостатический метод – при посеве в исходный материал добавляют некоторые химические вещества или антибиотики, которые угнетают рост одних микроорганизмов, не влияя на другие (например, пенициллин задерживает рост грамположительных микроорганизмов, не влияя на грамотрицательные; 5 % р-р H2SO4 убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает);
г) метод обогащения – посев на элективные питательные среды;
д) метод заражения лабораторных животных или растений – заражают исследуемым материалом восприимчивые к возбудителю виды животных или растений; после появления признаков заболевания производят посев органов и тканей на питательные среды (применяют для выделения патогенных видов микроорганизмов и отделения их от сапрофитов).
5. Для выделения чистых культур большинства бактерий обычно затрачивается не более 2-3 суток (для выращивания микобактерий туберкулеза – 4-6 недель). Процесс выделения чистой культуры можно разделить на три этапа: а) отделение чистой культуры; б) накопление чистой культуры; в) идентификация – заключение о видовой принадлежности.
6. Первый этап (1-ый день):
а) из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму (или другим методом) и микроскопируют;
б) производят посев исследуемого материала (смеси бактерий) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при 37° С на 24-48 часов (на этом этапе можно использовать и какой-либо биологический способ).
Второй этап (2-ой день):
а) наблюдают результаты посева и проводят описание колоний разных видов по следующим признакам: размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция;
б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму для изучения морфологических и тинкториальных свойств; убеждаются в том, что колония содержит один вид бактерий;
в) осуществляют пересев одной или нескольких различных изолированных колоний в отдельные пробирки со скошенным МПА для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37° С 24 часа.
Третий этап (3-ий день):
а) отмечают характер роста выделенной чистой культуры на МПА (визуально она характеризуется однородным ростом);
б) готовят мазок, окрашивают по Граму (или другим методом) и микроскопируют; при наличии чистой культуры обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки (исключение – полиморфные организмы);
в) производят посев на жидкие и полужидкие среды Гисса и МПБ для изучения биохимических (сахаролитических и протеолитических) свойств чистой культуры; оставляют в термостате при 37° С на 24 часа;
г) проводят идентификацию выделенной чистой культуры по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и др. свойствам; делают окончательный вывод о видовой принадлежности выделенной чистой культуры.
Морфологические признаки – форма, расположение и размеры бактериальных клеток.
Тинкториальные признаки – отношение к различным красителям. Эти признаки изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами (например, по Граму) и нативных препаратов.
Культуральные признаки – морфологические особенности колоний и характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.
Биохимические признаки – способность ферментировать белки, углеводы и другие соединения с образованием различных продуктов (определяются набором ферментов).
В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если это является достаточным для их идентификации.
В необходимых случаях проводят изучение других признаков, например, восстановление нитратов, декарбоксилирование аминокислот, образование оксидазы, плазмокоагулазы, фибринолизина и других ферментов, а также определение антигенной структуры, чувствительности к фагам, вирулентности и т.д. Для этого проводят дополнительные исследования по определению соответствующего маркера (фермента, антигена, чувствительности к фагам).
