Цель. Выделение микобактерии туберкулеза
Показания. Подозрение на туберкулез легких.
Оснащение. Стерильная сухая банка с плотно закрывающейся крышкой.
Техника взятия мокроты на микобактерии туберкулеза
1. Накануне вечером пациента предупреждают о предстоящем исследовании следующим образом: «Завтра с 6.00 утра вам нужно начать собирать мокроту на исследование. Мокрота на назначенное вам исследование собирается в течение суток. Это значит, что всю мокроту, которая будет у вас выделяться при кашле, необходимо сплевывать в эту банку. Банку, пожалуйста, ставьте в прохладное место и плотно закрывайте крышкой». Необходимо показать пациенту то место, где в течение суток будет храниться банка с мокротой.
2. При исследовании мокроты на микобактерии туберкулеза необходимо трехкратное получение материала в течение суток
.
3. Собранную мокроту отправляют в бактериологическую лабораторию.
4. Результат исследования вклеивают в медицинскую карту стационарного больного.
Примечания. Если у пациента выделяется мало мокроты и ее будет недостаточно для исследования, то мокроту можно собирать в течение 3 сут, сохраняя в прохладном месте.
Иллюстрация
3: Микроскопирование препарата
Срок доставки материала в лабораторию при комнатной температуре в течение 1-2 часов, при температуре 2-8°С – 5-6 часов.
Бактериологическое исследование мокроты позволяет обнаружить возбудителей заболеваний легких. Гнойный, кровянистый комочек мокроты растирают между двумя предметными стеклами. Высохшие мазки фиксируют на огне, затем один окрашивают по Граму, другой по Цилю — Нельсену.
Техника окраски по Граму:
1. Подготавливают бумажки, пропитанные генциановым или кристаллическим фиолетовым. Для этого полоски фильтровальной бумаги пропитывают 1% раствором красителя и высушивают.
2. На фиксированный мазок накладывают бумажки, пропитанные краской, заливают небольшим количеством воды, краситель быстро диффундирует и окрашивает мазок.
3. Окраску ведут 2 минуты, затем бумажку удаляют пинцетом.
4. Не промывая препарат водой, сливают краску и наносят раствор Люголя на 30-60 секунд до почернения препарата, затем раствор Люголя сливают.
5. Не промывая водой, погружают препарат в 96% этанол на 20-30 секунд. Обесцвечивание спиртом производят до отхождения фиолетовых струй краски.
6. Препарат тщательно промывают водой для удаления спирта.
7. Окрашивают мазок водным фуксином 2 минуты.
8. Промывают мазок водой до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными.
9. Высушивают препарат фильтровальной бумагой.
10. Грамположительные микробы окрашиваются в сине-фиолетовый, грамотрицательные — в красный цвет.
Иллюстрация
4: Набор препаратов для окраски по Граму
а) раствор генцианового фиолетового
б) раствор Люголя
в) раствор фуксина
Иллюстрация
5: Окраска по Граму
Иллюстрация
7: Стрептококк, окраска по Граму
Иллюстрация
8: Стафилококк, окраска по Граму
Когда препарат открашен по Граму, в нем можно обнаружить различные микроорганизмы. В частности, в препарате будут явно видны грамположительные капсульный пневмококк, стрептококк и стафилококк.
Встречается также клебсиелла (известная как грамотрицательная капсульная диплобацилла Фриндлера), палочка Пфейффера и многие другие их типы. Необходимо понимать, что незначительное число таких микроорганизмов всегда присутствует в дыхательных путях полностью здорового человека.
Однако, если организм попадает в особые условия, то микроорганизмы становятся патогенными и приводят как к возникновению, так и к развитию ряда заболеваний, включая пневмонию, абсцесс легкого, не говоря уже про бронхит и многие другие болезни.
У пациента, страдающего от таких заболеваний, в мокроте можно найти множество подобных микроорганизмов. Впрочем, лишь их количество не говорит о том, что эти микроорганизмы являются патогенными.
Окраска по методу Цилю-Нильсена. Этот метод применяют для окрашивания кислотоустойчивых микроорганизмов, которые не окрашиваются с помощью других методов, и для выявления спор.
Техника окраски:
1. Фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой, на которую наливают карболовый фуксин Циля.
2. Держа препарат пинцетом, мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров.
3. Добавляют новую порцию красителя и повторяют манипуляцию в течение 3-5 минут.
4. Снимают бумажку пинцетом и после охлаждения предметного стекла до комнатной температуры тщательно промывают мазок водой.
5. Обесцвечивают мазок 5% раствором серной кислоты, опуская предметное стекло на 20-30 секунд в стаканчик с кислотой.
6. Тщательно промывают водой.
7. Окрашивают спиртоводным раствором метиленового синего в течение 5 минут, промывают водой и высушивают, осторожно накладывая фильтровальную бумагу.
Кислотоустойчивые бактерии достаточно хорошо держат новую окраску, не теряют цвета и имеют красный цвет, который хорошо выделяется на синеватом фоне других составляющих мокроты. Эти составляющие лишены цвета или имеют иной окрас.
Иллюстрация
9: Набор для окраске по методу Циля-Нильсена
Иллюстрация
10: Микобактерии туберкулеза
Если микобактерий в материале мало и их не удается обнаружить в мазках обычным путем, применяют методы обогащения — гомогенизации и флотации, также применяется такой метод накопления, как электрофорез.
Метод гомогенизации. Суточное количество мокроты выливают во флакон или банку. Добавляют равный объем 1%-го водного раствора гидроксида натрия, плотно закрывают резиновой пробкой и энергично встряхивают до полной гомогенизации (10 — 15 минут). Мокроту, утратившую вязкость, центрифугируюют, осадок нейтрализуют с добавлением 2-3 капель 10%-й соляной кислоты или 30%-й уксусной кислоты. Из осадка готовят мазки и окрашивают по методу Циля-Нильсена.
Метод флотации.
1. Суточное (иногда 2-суточное) количество мокроты гомогенизируют описанным выше способом.
2. Для того чтобы в материале не осталось слзистых комочов, флакон с гомогенизированной мокротой помещают на 30 мин в водяную баню при 55 градусах по Цельсию.
3. Затем добавляют 1-2 мл ксилола (можно вместо ксилола добавить бензин, бензол и т. п.) и встряхивают в течение 10 минут
4. Доводят дистиллированной водой уровень жидкости до горлышка флаконы и дают ей 20-30 минут отстояться при комнатной температуре. Кпельки кслола с адсорбированными микобактериями всплывают, образуя сливкооборазный слой — флотационное кольцо.
5. Материал из флотационного кольца берут петлей в форме улитки или пипеткой и наносят на предметное стекло, помещенное на подогретое до 55 градусов по Цельсию над водяной баней стекло.
6. Высохший мазок покрывают новой парцией материала до тех пор, пока на предметное стекло не будет перенесена большая часть флотационного слоя.
7. Препарат промывают эфиром, высушивают, фиксируют и окрашивают по методу Циля-Нильсена.
Технология электрофореза. Через разжиженную мокроту подается постоянный ток, и микобактерии начинают перемещатся к катоду. Далее достаточно взять мазки с поверхности такого катода и окрасить их по методу Циля-Нильсена.
Для микроскопической диагностики туберкулеза широко применяют люминесцентную микроскопию. Фиксированный препарат окрашивают 15 мин аурамин-родамином (при подогревании), затем обесцвечивают 3%-м солянокислым спиртом (погружением на 30 с), при необходимости для погашения фона докрашивают перманганатом калия (КМпО4) или метиленовым синим, тщательно промывают и микроскопируют в ультрафиолете при увеличении от 250х до 650х. Наблюдают ярко-желтое свечение микобактерий на темном фоне.
При микроскопическом исследовании следует уделить особое внимание осмотру всей площади мазка. Чтобы с уверенностью судить о наличии или отсутствии микобактерий в препарате, следует просмотреть не менее 100 полей зрения.
Бактериоскопический метод позволяет лишь обнаружить кислотоустойчивые микобактерии, поэтому является ориентировочным методом диагностики. Для точной дифференциации микобактерии необходимо применить другие методы, в частности бактериологический .
Если исследования бактериоскопического типа не позволяют найти возбудителя заболевания, необходимо воспользоваться методом посева мокроты на питательные среды. Бактериологичекое исследование дает возможноть идентифицировать микробов, выяснить показатели их вирулентности и устойсивости к антибиотикам.
Если же возбудителя не удается выявить при помощи стандартных методов, то у пациента берется образец мокроты, который применяется для заражения лабораторных животных.
