Иммунодиагностика — использование реакций иммунитета для диагностики инфекционных заболеваний.
Реакции иммунитета — реакции между антигеном (Аг) и антителом (Ат). Они описываются простым уравнением Аг + Ат = результат. Основная их характеристика — специфичность. Реакции иммунитета к лаборатории применяют в двух направлениях:
— для серологической диагностики, т.е. для определения в исследуемом материале (чаще сыворотка крови) неизвестных Ат, используя для этого стандартный антигенный препарат-диагностикум, приготовленный, как правило, из эталонных штаммов микроорганизмов;
— для иммуноиндикации, т.е. для обнаружения в исследуемом материале микробных Аг, т.е. определения присутствия антигенов возбудителя с помощью известного Ат, содержащегося в иммуно-диагностических сыворотках.
Реакция агглютинации и ее разновидности
Агглютинация — склеивание и осаждение микроорганизмов, эритроцитов или других клеток при действии на них специфических Ат в присутствии электролита. Выделяют две фазы реакции.
— В первой, специфической фазе происходит взаимодействие Ат с Аг и образование комплекса Аг-Ат.
— Во второй, неспецифической фазе комплекс Аг—Ат выпадает в осадок. Это происходит только в присутствии электролита.
Реакцию агглютинации по идентификации ставят как в ориентировочном, так и в развернутом вариантах. Ориентировочную реакцию агглютинации ставят на предметном стекле с неразведенными или разведенными 1:10 адсорбированными агглютинирующими сыворотками, содержащими Ат одной специфичности. Результаты учитывают невооруженным глазом через 2—5 мин. Реакция считается положительной, если в результате отмечают появление хлопьев, жидкость становится прозрачной. При отрицательном результате жидкость остается мутной, хлопья не образуются.
При постановке реакции агглютинации по идентификации с не- адсорбироваными сыворотками на стекле необходим второй развернутый вариант: иммунную агглютинирующую сыворотку разводят до титра, обязательно используя разведение до 1/2 титра. Культуру считают идентичной взятой сыворотке, если она агглютинируется ей в разведении 1/2 титра и выше, так как в этих разведениях содержатся только видовые Ат.
Реакцию агглютинации ставят и с целью определения Ат в сыворотке больного, а также их количества. В качестве Аг используют диагностикум. В пробирках готовят ряд двукратных разведений сыворотки. В каждую пробирку вносят 1—2 капли диагностикума, помещают их на 2 ч в термостат при 37 °С, после чего предварительно учитывают результаты, начиная с контрольных пробирок. Отсутствие агглютинации в контрольных пробирках (помутнение) и появление хлопьев в опыте свидетельствуют о наличии Ат. Диагностически значимым считают нарастание титра Ат в парных сыворотках больного, взятых в разные дни болезни. Подобная динамика свидетельствует об инфекционном происхождении Ат.
Существуют разновидности реакции агглютинации — реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция коагглютинации, реакция торможения пассивной (непрямой) гемагглютинации (РТПГА).
Реакция пассивной гемагглютинации
Пассивная (непрямая) геммагглютинация — взаимодействие Ат (Аг) с Аг (Ат), предварительно адсорбированными на поверхности эритроцитов. Если комплекс образовался, то эритроциты склеиваются и выпадают в осадок. Реакцию ставят в лунках полистироловых планшетов, в которых готовят разведение парных сывороток, в последних лунках 2 контроля: заведомо положительная сыворотка и физиологический раствор. Затем последовательно во все лунки с разведениями добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум и инкубируют 2 ч. Если произошла гемагглютинации, то эритроциты оседают на дне лунки, заполняя всю лунку (зонтик). Если результат отрицательный, эритроциты оседают в центре (пуговка). Это позволяет установить титр Ат и его нарастание.
При иммуноиндикации реакцию ставят качественно с антительным фитроцитарным диагностикумом и фильтратом исследуемого материала.
Реакция коагглютинации
Реакцию коагглютинации чаще используют в вирусологии, так как она позволяет обнаружить невидимую на глаз вируснейтрализацию. Она основана на том, что Staphylococcus aureus имеет в составе клеточной стенки белок А, способный связываться с Fc-фрагментом IgG и IgM. Активные центры Ат свободны и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами Аг. При постановке реакции на предметное стекло наносят взвесь стафилококков, сенсибилизированных соответствующими Ат, к которой добавляют каплю взвеси исследуемых вирусов. Если Аг соответствуют Ат, через 30—40 с происходит агглютинация между образовавшимися комплексами Аг—Ат, содержащими белок А.
Реакция торможения пассивной (непрямой) гемагглютинации
РТПГА используют для обнаружения Аг возбудителей в исследуемом материале при добавлении к нему диагностической иммунной сыворотки. При наличии гомологичного Аг происходит связывание Ат, а после добавления сенсибилизированных Аг эритроцитов их агглютинации не происходит. Отсутствие гемагглютинации расценивается как положительный результат реакции. Реакцию РТПГА применяют и для обнаружения специфических Ат. Для этого к исследуемой сыворотке добавляют Аг. Если в ней содержатся специфические Ат, то они связываются с Аг. При добавлении эритроцитов, сенсибилизированных Ат, их склеивания не происходит. Оценку результатов лучше проводить при работе с разведениями парных сывороток.
Реакция преципитации и ее разновидности
Реакция преципитации — осаждение (преципитация) Аг, находящегося в дисперсном, коллоидном состоянии под действием специфических Ат. Существует несколько разновидностей постановки этой реакции.
Кольцепреципитация
Эту реакцию ставят в преципитационных (узких) пробирках с иммунной преципитирующей сывороткой, на которую наслаивают растворимый Аг. При эквивалентном соотношении Аг и Ат на границе двух растворов образуется белое кольцо преципитации.
Если в качестве Аг в этой реакции используют прокипяченный и профильтрованный водный экстракт органов и тканей, то реакцию называют термопреципитацией (реакция Асколи для диагностики сибирской язвы).
Иммунодиффузия
Метод основан на взаимодействии гомологичных Ат и Аг в агаровом геле с образованием полос и колец преципитации. Иммунодиффузию используют для определения токсигенности дифтерийных бактерий, концентрации иммуноглобулинов в сыворотке и др.
В последнем случае на стеклянную пластинку строго определенного размера (или в чашку Петри) аккуратно заливают расплавленный агар, содержащий в определенной концентрации антисыворотку к тому или иному классу иммуноглобулинов. В центре слоя застывшего агара и по периферии пробойником делают лунки, располагая их на определенном, одинаковом расстоянии друг от друга. В центральную лунку вносят стандартную сыворотку с известной концентрацией иммуноглобулина, например IgG, а в периферические лунки — исследуемые сыворотки. Из стандартных и исследуемых сывороток IgG диффундирует в агар. При образовании комплекса происходит его диффузия в агар, образуются кольца преципитации. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации иммуноглобулина. Величину диаметра соотносят с калибровочной прямой, построенной по стандартным сывороткам, и определяют содержание иммуноглобулина в исследуемых сыворотках.
Иммуноэлектрофорез
Иммуноэлектрофорез основан на электрофоретическом разделении Аг в геле с последующей их преципитацией Ат иммунной сыворотки. Иммуноэлектрофорез позволяет провести углубленный анализ и идентификацию отдельных Аг в многокомпонентных системах.
На пластинку из стекла наносят слой агара. Вначале антигены, помещенные в центре такой пластинки, разделяют в электрическом
поле. Затем в канавку агара, вырезанную параллельно линии разделения Аг, добавляют иммунную сыворотку, происходит диффузия компонентов реакции навстречу друг другу, и в месте встречи образуются дуги преципитации. С помощью этого метода анализируют состав белков сыворотки крови, спинномозговой жидкости, мочи.
Иммуноблоттинг
Метод основан на сочетании электрофореза и иммуноферментного анализа (ИФА). В полисахаридном геле с помощью электрофореза выделяют Аг, затем проводят блоттинг (наложение), т.е. переносят его из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и продолжают электрофорез. После чего на пленку наносят сыворотку пациента и инкубируют. Далее отмывают несвязавшиеся Ат и проводят ИФА. Для этого на пленку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и субстрат, который меняет окраску при взаимодействии с ферментом. Если образуется комплекс Аг—Ат—антисыворотка к иммуноглобулинам, на носителе появляются окрашенные пятна.
Реакция лизиса
Реакция иммунного лизиса. Реакция основана на том, что Ат-лизины способны растворять микроорганизмы только в присутствии комплемента. Для проведения реакции готовят ряд разведений инактивированной нагреванием сыворотки, затем добавляют взвесь микроорганизмов и комплемент. Всё инкубируют. После инкубации в термостате проводят оценку результатов с помощью высевов с количественным учетом. Для контроля используют исследуемую культуру микроорганизмов, нормальную сыворотку и комплемент.
Реакция связывания комплемента
Реакция связывания комплемента (РСК) — сложная, многокомпонентная реакция, состоящая из двух систем:
• первая система (тест-система): Аг+Ат+комплемент, где Аг или Ат — неизвестный компонент;
• вторая система (индикаторная, или гемолитическая, система): эритроциты барана + гемолитическая сыворотка.
Если на первом этапе реакции произошло специфическое взаимодействие Аг и Ат, то комплемент адсорбируется на образовавшемся комплексе. Процесс связывания комплемента визуально не проявляется. В связи с этим используют вторую индикаторную систему — гемолитическую, состоящую из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки (гемолитическую сыворотку получают при иммунизации кролика эритроцитами барана). Эта индикаторная система высокочувствительна к свободному комплементу. В его присутствии происходит иммунный гемолиз.
В зависимости от присутствия обнаруживаемых Аг или Ат возможно два исхода.
• Если на первом этапе образовался комплекс Аг-Ат, то на нем адсорбируется комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза не происходит, так как комплемента в свободном состоянии не осталось. (Все компоненты реакции берутся в строго определенных рабочих дозах.)
• Если в исследуемой сыворотке комплекс Аг—Ат не образовался, то комплемент остался в свободном состоянии, и он адсорбируется на комплексе гемолитической системы. Визуально это проявляется в лизисе эритроцитов и образовании «лаковой» крови.
Перед постановкой РСК все компоненты, участвующие в реакции, титруют.
Титр гемолитической сыворотки — ее наибольшее разведение, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов в течение 1 ч при 37 °С.
Рабочая доза гемолитической сыворотки равна тройному ее титру.
Титр комплемента — наименьшее его количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов.
Рабочая доза комплемента — в основном опыте РСК (в объеме 0,5 мл) должна быть выше титра на 20—30%.
Тктр антигена — минимальная доза, не вызывающая задержку гемолиза.
Для РСК используют рабочую дозу Аг = 1/2 ее титра.
Реакции иммунитета с использованием метки
Реакция иммунофлюоресценции
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) основана на использовании флюорохромов, химически связанных с Ат. При этом меченные люминесцентной меткой Ат вступают во взаимодействие с корпускулярным Аг. Образовавшиеся специфические комплексы обнаруживают по интенсивному свечению, регистрируемому с помощью люминесцентного микроскопа. Существуют разновидности этой реакции.
При постановке прямой РИФ используют противомикробные флюоресцирующие Ат, т.е. реакция происходит против возбудителя.
Непрямая РИФ (РНИФ) проходит в два этапа. На первом этапе используют обычные антисыворотки к анализируемому возбудителю. Образовавшиеся при этом комплексы Аг-Ат на втором этапе выявляют с помощью люминесцентной сыворотки, которая содержит меченые Ат против иммуноглобулина того вида животного, сыворотка которого использована на первом этапе реакции.
Иммуноферментный анализ
Метод основан на использовании меченных ферментом сывороток. Индикацию образовавшихся комплексов проводят по химической реакции между ферментом и субстратом, сопровождающейся изменением цвета. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов Аг и меченных ферментом Ат. В качестве фермента чаще всего бывает пероксидаза или щелочная фосфатаза. Для проведения анализа используют твердофазный носитель с сорбированным Аг или Ат. Реакцию можно ставить для обнаружения как Аг, так и Ат.
Основные этапы реакции по обнаружению Ат:
• Сорбция известного Аг в лунке планшета.
• Внесение исследуемой сыворотки; промывка.
• Внесение меченной ферментом антиглобулиновой сыворотки; промывка.
• Внесение хромогенного субстрата.
• Регистрация реакции.
Основные этапы реакции по обнаружению Аг:
• Сорбция известного Ат в лунке планшета.
• Внесение Аг содержащего материала; промывка.
• Внесение Ат той же специфичности, но другого вида животного.
• Внесение меченной ферментом сыворотки против иммуноглобулинов того вида животного, сыворотка которого была использована последней; промывка.
• Внесение хромогенного субстрата.
• Регистрация реакции.
Радиоиммунный метод
В основе радиоиммунного анализа (РИА) лежит использование Ат, меченных радиоактивной меткой. Материал, в котором ищут неизвестный Аг, обрабатывают такой сывороткой. Если в исследуемом материале есть соответствующий Аг, образуется комплекс Аг—Ат, обладающий радиоактивностью, которую легко выявить с помощью специального счетчика. Если соответствующих Аг в исследуемом материале нет, то меченные радиоактивной меткой Ат не связываются и легко удаляются на этапе промывания. Как и реакция иммунофлюоресценции, радиоиммунный анализ может быть проведен в прямом и непрямом вариантах для обнаружения Аг
Молекулярно-генетические методы исследования
ДНК-гибридизация
Различают две методики гибридизации:
• гибридизация, проводимая в растворе;
• гибридизация, проводимая на твердой поверхности.
Гибридизация в растворе
При реализации этого метода искомая нуклеиновая кислота и зонд взаимодействуют в водной реакционной смеси, что повышает скорость процесса гибридизации.
Метод ДНК-гибридизации основан на способности денатурированной одноцепочечной ДНК достраивать гомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для второй цепи используют ДНК-зонды (коммерчески производимые фрагменты молекулы известной ДНК, гомологичные фрагментам искомой ДНК возбудителя, меченные радиоактивным изотопом или ферментом).
При наличии в исследуемом материале гомологичных участков ДНК по закону комплементарности ДНК-зонд взаимодействует с ним.
Учет результатов проводят по уровню радиоактивности или при добавлении к пробе субстрата, который соответствует используемому в зонде ферменту. Образование специфического комплекса субстрат-фермент означает, что в исследуемом материале есть ДНК, соответствующая ДНК-зонду.
Гибридизация на твердом носителе (блот-гибридизация)
Основана на ДНК-гибридизации зонда на твердой поверхности, в качестве которой используют полимерный мембранный фильтр. Основные этапы исследования:
• исследуемый образец обрабатывают ультразвуком для получения коротких фрагментов находящихся в нем ДНК;
• проводят денатурацию нуклеиновой кислоты;
• денатурированные нуклеиновые кислоты наносят на мембранный фильтр и фиксируют;
• проводят предварительную гибридизацию со специальным буфером при 65 °С;
• добавляют гибридизационный буфер, который содержит денатурированный зонд, и проводят гибридизацию при 65 °С.
«Сэндвич»-гибридизация
Этот метод предполагает использование двух видов ДНК-зондов, которые гомологичны различным участкам искомой нуклеиновой кислоты. Чтобы связать искомую нуклеиновую кислоту, присутствующую в исследуемом образце, один зонд фиксируют на мембране. После окончания процесса гибридизации мембрану отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, который содержит второй зонд, несущий метку. После этого процесс гибридизации повторяют, при этом меченый зонд взаимодействует с искомым участком нуклеиновой кислоты. Окончательная детекция зависит от характера меток, которые могут быть ферментно-гибридизационными, флюоресцентными, хемилюминесцентными и т.д.
Гибридизация in situ
Процесс гибридизации проводят непосредственно на срезе или в мазке с использованием зондов. Основу метода составляет принцип твердофазной гибридизации или гибридизации в растворе. Используемый в реакции зонд содержит флюоресцентную метку. После окончания процесса гибридизации связавшиеся молекулы в исследуемом мазке или срезе выявляют под флюоресцентным микроскопом. При данном методе возможен количественный анализ.
Полимеразная цепная реакция
Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) основан на естественной репликации ДНК, которая включает денатурацию спирали ДНК, расхождение нитей и комплементарный синтез новых нитей ДНК. ПЦР обеспечивает амплификацию фрагментов генома и быстрое накопление определенной последовательности ДНК. В результате получают большое количество ДНК, которое достаточно для проведения анализа различными методами детекции.
Для реакции используют набор праймеров фрагментов ДНК, которые являются маркерами данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащей денатурированную одноцепочечную ДНК возбудителя, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК. Образовавшиеся двунитевые фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, и так повторяется много раз, поэтому реакция носит цепной характер. За 2-3 ч происходит 30-40 циклов амплификации, что приводит к образованию большого количества соответствующих копий нуклеотидных последовательностей, которое можно зарегистрировать.
Компоненты реакции:
• Праймеры-олигонуклеотиды, состоящие из 15-30 нуклеотидов, комплементарных участкам на идентифицируемой матричной ДНК.
• Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов — строительный материал, используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.
• Taq-полимераза, обладающая ДНК-полимеразной активностью.
• Буферный раствор, катализатор фермента Taq-ДНК-полимеразы.
• Исследуемый образец — препарат, который служит мишенью для последующей амплификации.
ДНК-чипы
Технология ДНК-чипов основана на гибридизации нуклеотидной последовательности исследуемого материала с известными ДНК-последовательностями, расположенными в определенном порядке, иммобилизованными на поверхности стекла или кремня. Результат реакции детектируют по флюоресценции зонда, предварительно меченного флюорохромом и гибридизированного с одной из иммобилизированных проб.
Биочип — матрица, состоящая из ячеек. В каждой ячейке закреплен олигонуклеотид (последовательность из нескольких нуклеиновых кислот). Каждый нуклеотид имеет одинаковую длину и отличается от другого последовательностью аминокислот.
Исследуемый образец наносят на все ячейки чипа, а затем через некоторое время сливают. Если имеется нуклеотид комплементарный шкрепленному в ячейке, то между ними образуется связь, и после нромывания они не удаляются. Затем образец исследуют под флюоресцентным микроскопом, который регистрирует результат образования комплекса по световому сигналу. Светящиеся ячейки кодируют олигонуклеотиды исходной пробы. Таким образом, зная нуклеотиды, которые были изначально помещены в данной ячейке, можно сделать нывод о составе фрагмента исследуемой ДНК.
