При использовании обычных методов определения чувствительности микробов к антибиотикам, ответ может быть получен не ранее чем через 48 часов от начала исследования. В большинстве случаев особенно при тяжёлом течении инфекционных процессов возникает необходимость быстрого определения антибиотикочувствительности микроорганизмов.
В зависимости от принципов, положенных в основу этих методов, их можно распределить на следующие группы:
1) методы, основанные на изменении ферментативной активности микроорганизмов при воздействии антибиотиками;
2) методы, основанные на изменении цвета редокс-индикаторов при изменении окислительно-восстановительного потенциала среды в процессе роста микробов в присутствии антибиотиков;
3) методы, основанные на цитологической оценке изменений морфологии бактериальных клеток под воздействием антибиотиков.
К первой группе относится метод Роджерса и соавт. (1953), основанный на способности антибиотиков подавлять ферментативную активность чувствительных к ним микробов, что сопровождается изменением цвета соответствующего индикатора. Сущность метода заключается в дифференцированном изменении красного цвета индикатора (фенолрот) в жёлтый или фиолетовый в зависимости от чувствительности микроорганизма к антибиотикам. В случае чувствительности к действию антибиотика штамма возбудителя не происходит сбраживания глюкозы при культивировании на среде, содержащей глюкозу, фенолрот (в качестве индикатора) и определенные концентрации антибиотика. При этом среда окрашивается в фиолетовый цвет вследствие ее подщелачивания. Изменение красного цвета среды на желтый свидетельствует о расщеплении глюкозы с образованием кислоты в результате роста штамма, устойчивого к действию присутствующего в среде антибиотика. При добавлении к среде культивирования 0,25 % дрожжевого экстракта результаты исследования могут быть получены через 2,5 часа после его начала.
Использование ускоренных методов, относящихся ко второй группе, основано на изменении окислительно-восстановительного потенциала питательной среды в процессе роста микроорганизмов о чем судят по изменению цвета добавляемых в среду индикаторов (резазурин 1,3,5-трифенилтетразолхлорид, 2,6-дихлорфенолиндофенол и др.). Эти методы отличаются технической простотой, а результаты исследования при их использовании могут быть получены в течение 2-6 часов. Для этого расплавленный и охлажденный до 500С питательный агар смешивают с агаровым смывом суточной изучаемой культуры (из расчета 200 млн. микробных тел в 1 мл питательной среды или 1 мл непосредственно исследуемого материала (гной, раневое отделяемое и т.д.). Выливают в чашку Петри в количестве 15 мл. На застывшей поверхности размещают диски, пропитанные антибиотиками. Чашки инкубируют при 370С в течение 3-5 часов, затем обрабатывают индикатором (3-5 мл на каждую чашку) и повторно инкубируют в течение 20-30 минут при температуре 370С. Учет результатов производят по изменению цвета среды вокруг дисков с антибиотиками. При использовании в качестве индикатора 1% раствора 1,3,5-трифенилтетразолхлорида участки агара с бактериальным раствором вследствие образования формазана окрашиваются в красный цвет, а зоны подавления роста микробов вокруг дисков с антибиотиками остаются бесцветными. При этом зоны подавления роста измеряются и оцениваются, как в методе диффузии в агар с применением дисков.
Наряду с химическими индикаторами используются и биологические, в частности, гемоглобин крови.
В установленные горизонтально стерильные чашки Петри заливают питательную среду в два слоя: нижний слой -15-20 мл среды с добавлением 10 % цитратной донорской крови, при этом среда должна быть ярко-красного цвета и верхний слой среды — без добавления крови, к которой после расплавления, а также охлаждения до 45-500С добавляют 1 мл испытуемой культуры микроорганизмов (из расчета 200 млн. микр. кл./мл) или 1 мл (или меньше) исследуемого материала (гной, раневое отделяемое и др.), тщательно перемешивают и выливают в чашки Петри на поверхность питательного агара с кровью.
На застывшую поверхность второго слоя накладывают диски с антибиотиками и чашки помещают в термостат при 370С на 5-6 часов.
Участки питательного агара с бактериальным ростом из ярко-красных становятся коричневато-бурыми, так как в процессе жизнедеятельности большинство штаммов микроорганизмов создают в питательной среде условия, способствующие переводу гемоглобина в метгемоглобин. Зоны подавления роста вокруг дисков с антибиотиками остаются окрашенными в ярко-красный цвет.
Указанные методы дают возможность судить о степени чувствительности микробов к антибиотикам с той же точностью, что и стандартный метод дисков, однако время исследования сокращается с 16-18 ч до 3-5 ч.
К ускоренным методам относят метод, с помощью которого обнаруживают образование инволюционных форм бактерий под действием антибиотиков при фазово-контрастной микроскопии. Инволюционные формы микроорганизмов образуются в присутствии бактериостатических концентраций антибиотиков. В отсутствии его при действии суббактериостатических концентраций, а также при устойчивости изучаемого штамма к препарату вырастают нормальные микроколонии. Морфологические изменения исследуемых культур под действием антибиотиков учитывают в специальных микрокамерах. Техника приготовления микрокамер состоит в следующем: в пробирки с 0,5-1 мл расплавленного МПА добавляют равные объёмы того или иного антибиотика в двукратно убывающих концентрациях. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и выливают на поверхность предметных стёкол. Полученный таким образом ряд стёкол с агаром, содержащим различные концентрации антибиотика, соответствует ряду чашек Петри или ряду пробирок с убывающими концентрациями антибиотиков при методе серийных разведений. Агар заражают (с помощью тонко оттянутой пастеровской пипетки) взвесью исследуемой культуры и накрывают покровным стеклом. Камеры без парафинизации помещают в термостат при температуре 370С на 3-5 часов. Результаты учитывают по образованию инволюционных форм микробов (при фазово-контрастной микроскопии) с установленными концентрациями антибиотиков, вызвавшей их образование (МПК).
При массовых исследованиях используют автоматизированные методы определения чувствительности к антибиотикам. Это позволяет упростить и ускорить проведение исследования. Наиболее часто применяют метод серийных разведений в планшетах и метод пограничных концентраций (микрометоды). В первом случае, как правило, используют готовые стерильные полистироловые 96-луночные планшеты, в лунки которых внесены лиофильно высушенные в бульоне убывающие концентрации антибиотиков. После вскрытия планшета стандартизированную суспензию испытуемой культуры в одинаковой дозе (например, 0,1 мл) асептически вносят в соответствующие ряды лунок, закрывают крышкой и инкубируют при оптимальной температуре. После инкубирования отмечают рост (помутнение бульона) в тех лунках планшета, где антибиотик не действует. При наличии помутнения бульона в контроле культуры и опытных лунках определяют величину МИК. Учет можно вести как визуально, так и с помощью специальных микробиологических анализаторов. В этих приборах имеется возможность автоматизации основных действий: внесения культуры, инкубирования, встряхивания, определения оптической плотности (степени мутности) жидкости в каждой лунке, графического отображения результатов (в том числе в динамике), определения степени чувствительности и печатания протокола исследования.
Метод пограничных концентраций можно считать усеченным методом серийных разведений. В соответствии с ним испытуемую культуру вносят только в две лунки (пробирки), где находятся высокая (С) и низкая (с) концентрации антибиотика. Концентрация С соответствует границе между устойчивыми и умеренно-устойчивыми штаммами, а концентрация с — границе между умеренно-устойчивыми и чувствительными штаммами. Если после инкубирования рост отсутствует в обеих лунках, штамм относят к чувствительным, если только в лунке с концентрацией С — к умеренно-устойчивым штаммам, а если в обеих лунках имеется рост, штамм относят к устойчивым. Результат этого исследования имеет качественное (полуколичественное) выражение, но само исследование отличается простотой и экономичностью.
Многие модификации метода серийных разведений сводятся к способу учёта результата: колориметрическое, турбидиметрическое, флюорометрическое исследование и др.
Среди других методов в настоящее время разработаны компьютеризированные системы, которые самостоятельно автоматически проводят выделение бактерий из исследуемых материалов и определяют их чувствительность к антибиотикам. Но стоимость их ограничивает широкое применение в отечественной практике. Из доступных методов наибольшее распространение нашли система Alamar и E-тест, совмещающие в себе методы серийных разведений и дисков.
Автоматизированные системы учета результатов метода серийных разведений (например, Baxter MicroSkan AutoSCAN-4)-инкубационные системы с встроенными фотометрами, нефелометрически регистрирующими рост бактерий или его отсутствие через 24 часа после внесения микроорганизмов в лунки микропанелей. Принцип работы основан на учёте разницы оптической плотности среды в лунках, где есть рост бактерий, и в лунках, где его нет. В настоящее время разработаны устройства (например, VITEK), позволяющие получать результаты уже через 4-10 часов.
Система Alamar представляет собой панель с лунками, в каждую из которых помещены диски из фильтровальной бумаги, содержащие различные концентрации антибиотиков и пропитанные индикатором Alamar Blue. После внесения в лунку бактерий диск синеет, а при их дальнейшем росте его окраска меняется на розовую. Порядок размещения дисков на лунках соответствует двойным серийным разведениям препарата. Последняя лунка с синим диском, соответствует МИК антибиотика.
Определение способности золотистого стафилококка продуцировать ? — лактамазу
В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 450С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 370С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать ? — лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг исследуемых культур до самого диска.
